Il museo riunisce le opere d'arte, disperse nel tempo, già appartenute alla Compagnia del Bigallo, ente attivo fin dal Medioevo in opere di beneficenza e assistenza. E' stato riaperto nel giugno 1998, al termine dei lavori di messa a norma. Dal luglio 2007 il percorso museale è stato ampliato con l'apertura al secondo piano della esposizione permanente : Leonardo a Firenze. Vi sono esposti riproduzioni scientifiche o interattive di macchine e disegni del grande maestro, unitamente a opere originali come l'incisione del nodo vinciano di Durer.